【关键词】 大蒜素;肺癌细胞A549;细胞周期;紫杉醇
在肿瘤化疗过程中，抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，亦损伤正常细胞。因此，最大限度地发挥抗癌药物对肿瘤细胞的杀伤作用，同时减少对正常细胞的毒 性越来越受到重视。大蒜是百合科葱属植物的磷茎，主要的生物活性物质是其特有的含硫化合物，包括甲基烯丙基硫、二烯丙基三硫、二烯丙基四硫、二烯丙基 硫代硫酸酯［1］。二烯丙基三硫又名大蒜素。研究发现大蒜素具有抗肿瘤作用，如可能改变调节致癌活性有关的酶活性 ［2］，参与提高肿瘤患者的免疫功能［3］，阻滞细胞周期，介导细胞凋亡和分化等［4-5］。但大蒜素与抗癌药物联合应用的研究不多，本研究将大蒜素作用于人肺癌A549细胞，以研究大蒜素对肿瘤细胞的阻滞作用以及与紫杉醇联合应用对肿瘤细胞的杀伤作用。
1 材料与方法
1.1 材料
人肺癌细胞系A549细胞、Annexin V 细胞凋亡试剂盒由南京凯基生物科技发展有限公司提供，大蒜素 注射液由上海禾丰制药有限公司生产，紫杉醇由四川太极制药有限公司生产。
RPMI1640培养基和胰酶购自Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青公司，噻唑蓝（MTT）、DMSO购自Amresco公司，96孔板购自 Costar公司，碘化丙啶（PI）、RNase为Fluka公司产品。
FACScan （B.DUSA）流式细胞仪;Bio-RAD Mod- el550（B.DUSA）酶标仪。
1.2 细胞培养
将A549细胞接种在50 ml培养瓶中，用含15%小牛血清的RPMI1640培养液，于37 ℃、5%CO2的培养 箱中培养，细胞贴壁80%时传代，1周传2～3次。实验用细胞为接种24 h后的对数生长期细胞。
1.3 MTT法检测大蒜素和紫杉醇对肺癌细胞A549的抑制作用 消化收集对数生长期细胞并调整成浓度为5×104ml-1的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，24 h后加入以RPMI1640培养液配置的大蒜素，终浓度分别为80、40、20、10和5 μg·ml-1 ，同时设立含RPMI1640全培养基的空白对照组。同法配置紫杉醇，终浓度分别为40、20、10、5和2.5 μg·ml-1。每一浓度设5个复孔，分别继续培养24、48和72 h;弃上清液后每孔加MTT50 μl，浓度为1 mg·ml-1，混匀，于37 ℃、5%CO2 的培养箱中孵育4 h;弃上清液后每孔加150 μl的DM-SO溶解蓝紫色颗粒，以酶标仪检测波长490 nm的每孔吸光度值（A值）。实验重复2次，计算细胞抑制率。
细胞增殖抑制率=（1-实验组光密度值/对照组光密度值）×100%。采用LOGIT药物浓度抑制统计分析 软件计算IC50 值。
1.4 细胞周期分析
用流式细胞仪检测，取生长状态良好的细胞接种在大方瓶中，培养至密度达60%～70%时分别加入不同浓度大蒜素，设立正常对照组，培养72 h收集细胞。收集的细胞以PBS洗3次，以70%乙醇4 ℃固定过夜，1 000 r·min-1离心5 min ，弃去乙醇，PBS洗3次后，加入10 μg·ml-1的RNase于37 ℃消化0.5 h，加入50μg · ml-1的PI于4 ℃染色0.5 h，流式细胞仪进行DNA含量和细胞周期分析，所用软件为Cellqest。
1.5 细胞凋亡检测
以Annexin V-FITC标记法定量检测紫杉醇和大蒜素联合应用时细胞凋亡的变化。将终浓度为IC50值 的大蒜素和紫杉醇分别加入肺癌细胞A549，培养72h;另一组细胞先经浓度为1/2IC50 值的大蒜素诱导24h后再加浓度为IC50值的紫杉醇作用72 h，并设立正常对照组。细胞用0.25%胰蛋白酶消化收集，PBS清洗2次，于4 ℃ 2 000 r·min-1离心5 min，收集（1～5）×105细胞，吸取250 μl的Binding Buffer和250 μl的灭菌去离子水，混匀;用上述500 μl的Binding Buffer悬浮细胞，加1 μl Annexin V - FITC，室温下混合，加入5μl浓度为20 mg ·L-1的PI，避光室温反应5 min，用流式细胞仪分析（绿色荧光用FL2来检测，红色荧光用FL1来检测）。
1.6 两药联合应用72 h时紫杉醇IC50值的变化
依据1.3所测的大蒜素和紫杉醇抑制肺癌A549 细胞72 h的IC 50 值，一组应用终浓度为IC50值大蒜素诱导培养细胞24 h后，紫杉醇再作用于A549细胞72 h检测紫杉醇IC50值的变化;另一组将IC 50 浓度大蒜素 与紫杉醇同时作用于A549细胞检测紫杉醇72 h IC50 值的变化。
1.7 统计学处理
数据采用 x-±s 表示，两组间均数比较采用 t 检验，多组均数比较采用方差分析LSD方法，所有数据采用SPSS10.0统计软件包作数据处理， P <0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 大蒜素和紫杉醇单独应用对肺癌细胞A549生长的抑制作用
对照组细胞呈正常对数生长，大蒜素对A549细胞生长有明显抑制作用，且呈时间、浓度依赖性。24和48 h时作用强度相对较弱，抑制率分别为2.28%～53.89%和0.70%～77.20%，72 h时抑制作用明显，抑制率为7.60%～92.51%， 1 2 3 下一页
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