【摘要】 通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase， LDH）的检测，观察解毒通络药物干预后的脑微血管内皮细胞条件培养液（ conditioned medium of cerebral microvascular endothelial cells， CMECs-CM）特征及其抗缺血及再灌皮质神经元损伤的效应，探讨脑微血管内皮细胞（cerebral microvascular endothelial cells， CMECs）调控神经元功能的机制。方法:通络救脑注射液（Tongluo Jiunao Injection， TLJNI）作用于正常、缺血和缺血再灌三种培养状态的大鼠CMECs，分别收集有药物干预及无干预的三对无血清内皮细胞条件培养液，并测定其LDH值。同步原代培养大鼠脑皮质神经元，亦分为正常、缺血、缺血再灌三组，用低（10%）、中（50%）、高（100%）三种浓度的各类CMECs-CM分别作用上述三种培养状态的神经元，测定其LDH漏出率。结果:比较TLJNI干预后的CMECs-CM与无干预的CMECs-CM中LDH漏出值，CMECs缺血组与缺血再灌组经药物干预后均明显降低（ P <0.01）。对于缺血神经元，缺血内皮细胞条件培养液（conditioned medi-um of ischemic CMECs， Is-CM）高浓度（100%）和TLJNI干预后的缺血内皮细胞条件培养液（conditioned medium of ischemic CMECs with drug treatment， IsT-CM）高浓度（100%）作用后表现为增加LDH漏出率（ P <0.01），而低浓度10%的IsT-CM则降低LDH漏出率（ P <0.05 ）;对于缺血再灌神经元，与对照组比较，各类CMECs-CM作用后均能降低神经元LDH漏出率（ P <0.05 或 P <0.01）。比较每种条件液相邻浓度间的效应差异，均以10%或50%的CM降低损伤为佳，正常内皮细胞条件培养液（conditioned medium of normal CMECs， N-CM）及缺血再灌内皮细胞条件培养液（conditioned medium of ischemic/reperfusional CMECs， Rp-CM）组间差异有统计学意义（ P <0.05或 P <0.01 ）;对于正常神经元，各类CMECs-CM作用后均增加了神经元LDH漏出率（ P <0.05或 P <0.01 ）。比较每种条件液相邻浓度间的效应差异，N-CM组间差异有统计学意义（ P <0.05或 P <0.01 ）。结论:TLJNI能够防御CMECs缺血及缺血再灌的损伤，可以通过内皮细胞介导发挥抗缺血及缺血再灌神经元损伤的效应。提示CMECs-CM及TLJNI干预后的CMECs-CM均存在着抗缺血再灌神经元损伤的活性物质。
【关键词】 脑微血管内皮细胞; 神经元; 脑缺血; 大鼠; 中药
近年来中药调节脑微血管内皮的研究日益受到人们的重视［1～3］，但整体动物实验无法将内皮细胞与脑细胞分离开来进行研究，本实验室采用大鼠大脑皮质微血管内皮细胞和神经元分离纯化培养的方法，可使其纯度分别达到98%，是研究二者之间关系的一种可靠的实验方法。通络救脑注射液（Tongluo Jiunao Injection， TLJNI）是治疗缺血性脑病的中药新药。初步实验证实，TNJNI在缺血内皮细胞损伤状态下具有可靠的维护脑微血管内皮功能的作用［4，5］。这种对脑微血管内皮细胞（cerebral microvascular endothelial cells， CMECs）的保护作用是否启动进一步的脑保护效应有待探知。本实验通过观察CMECs缺血损伤及通络救脑注射液干预后的不同条件培养液（conditioned medium， CM）抗缺血神经元损伤的效应，探讨CMECs与神经元的功能联系，并进一步阐明通络救脑注射液的“解毒通络”作用机制，对于深化“毒损脑络”病机［6］的生物学理论内涵具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物 雄性SD大鼠18只，体质量 60～80 g ，用于同一批CMECs原代培养。新生SD大鼠（24 h内）4只，用于同一批原代神经元培养。动物合格证号为SCXK京2002-0003，清洁级，购自北京维通利华实验动物中心。
1.1.2 药物 通络救脑注射液，批号为04061011，购自内蒙古康源药业有限公司。 药物组成为栀子和三七，提取分离有效成分栀子苷和三七总皂苷，配伍制成注射液，该注射液含原药有效成份为 7.7 mg/ml。
1.2 实验方法 通过乳酸脱氢酶（lactate dehydro-genase， LDH）的检测，观察正常、缺血及缺血再灌不同状态的脑微血管内皮细胞条件培养液（condi-tioned medium of cerebral microvascular endotheli-al cells， CMECs-CM）和 TLJNI干预后的CMECs-CM抗缺血及缺血再灌皮质神经元损伤的特征效应。
1.2.1 解毒通络药物干预后的CMECs-CM的收集
1.2.1.1 CMECs的培养 雄性SD大鼠18只，体质量60～80 g，用于同一批CMECs原代培养。无菌条件下取出双侧大脑半球，置预冷的冲洗液（DMEM培养液，10%新生牛血清、青霉素 1×105U/L ，链霉素1×10 5U/L）中，剔除软脑膜、表面血管及白质，收集皮质。剪碎成1 mm 3的小块，置手动玻璃匀浆器，冰上操作上下匀浆约25次。依次通过80目和200目尼龙网过滤，收集200目滤网上微血管段。用0.1%胶原酶，37 ℃消化30 min。冲洗液冲洗两遍，1 000 r/min（RCF:201× g ）离心 5 min ，将微血管段重悬于完全培养基DMEM培养液，胎牛血清20%;内皮细胞生长支持物（endotheli-al cells growth support， ECGS）75 mg/L、肝素钠 4× 10 4U/L、青霉素1×105U/L、链霉素 1×105U/L 、胰岛素200 U/L、 L -谷氨酰胺 2 mmol/L 中，接种于2%明胶预先包被的25 cm 2培养瓶（Costar公司）中，共3瓶，37 ℃、5%CO2培养箱静置培养48 h后，第1次换液。第7天细胞基本融合成片，进行消化传代，消化液为体积比为1∶1的 0.125% 的胰蛋白酶与0.02% EDTA。
二代经过Ⅷ因子免疫荧光鉴定，其纯度可达98%。培养的第二代CMECs 90%汇合后经消化后再传代，传到25 cm2培养瓶共12瓶。本实验用第三代细胞，将实验细胞分为正常、缺血（ischemia， Is）和缺血再灌（ischemia/reperfusion， I/R）三组 1 2 3 4 下一页
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