【关键词】 中医药; 血管; 血管内皮细胞生长因子; 免疫组织化学; 毛囊; 小鼠
活血补肾合剂（Huoxue Bushen Mixture， HXBSM） 是龙华医院皮肤科经验方，临床治疗脱发取得了良好的疗效［1］。本实验观察活血补肾合剂对小鼠毛发生长、局部血管新生及毛囊中血管内皮细胞生长因子 （vascular endothelial growth factor， VEGF）表达的影响，旨在从微观结构和细胞因子水平对活血补肾合剂促进毛发生长作用的机制加以阐释。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物 C57BL/6小鼠，普通级，8周龄，体质量（20±2）g，雄性，由上海中医药大学实验动物中心提供。
1.1.2 药物来源与制剂加工 活血补肾合剂由地黄30 g、丹参40 g、益母草20 g、玄参15 g、黄芪 40 g 、党参20 g、麦冬15 g、猪苓20 g、金钱草40 g、白花蛇舌草40 g共10味中药组成，由龙华医院制剂室制备（沪药制字z05170520），含生药4 g/ml。养血生发胶囊（熟地黄、当归、羌活、木瓜、制何首乌等）由广州敬修堂药业股份有限公司生产，批号030263。生理盐水，上海市富民制药厂生产。
1.2 造模、分组及药物处理
1.2.1 动物模型建立 参考文献［2］建立动物模型，将按1∶1的比例混合的松香和石蜡加热融化后涂于C57BL/6小鼠背部，凝固变硬后揭去，从而达到脱毛的效果。每只小鼠脱毛区域约为2 cm×2 cm。
1.2.2 动物分组及药物处理 按《药理与中药药理实验》［3］人鼠等效剂量换算方法计算各种药物的人鼠等效剂量。C57BL/6小鼠，共90只，随机分为 3组 ，每组30只。活血补肾合剂组，以生药 25 g/（kg·d） 剂量灌饲;养血生发胶囊（Yangxue Shengfa Capsule， YXSFC）组，以0.36 g/（kg·d）剂量灌饲; 模型组，生理盐水0.4 ml/d灌胃。以上 3组 每天灌服药物1次，从造模后第1天起，连续给药17 d。
1.3 检测指标与方法
1.3.1 肉眼观察 各组小鼠拔毛局部皮色变化及毛发生长情况。
1.3.2 光学显微镜下观察 分别于造模后第4、 11天 用断颈法每组随机处死10只小鼠，第17天用 同样方法处死各组剩余小鼠。在每只小鼠拔毛部位切取新鲜皮肤标本，固定于10%中性甲醛，经脱水，透明，渗蜡，包埋，连续切片，并进行HE染色，观察真皮浅层毛细血管数（条）。以200倍视野计数，每张切片数5个视野，计算平均值［4］。
1.3.3 检测VEGF表达 采用免疫组织化学法。
1.3.3.1 检测方法 免疫组化Envision二步法测定VEGF（VEGF抗体为Santa Cruz Biotechnology 公司产品，工作浓度1∶25～1∶50），与HE染色同步进行。
1.3.3.2 图像分析 采用Leica DMIRB倒置像差显微镜和 Leica Q 500 IW图像分析仪，选择200倍视野，每张免疫组化切片任选2个视野，分析视野中免疫组化切片染色阳性面积占整个视野面积的百分比。
1.4 统计学方法 实验数据用 x ± s 表示。采用SPSS for Windows软件包进行完全随机设计资料的两因素方差分析。
2 结果
2.1 各组小鼠拔毛局部毛发生长情况 各组小鼠在造模时皮肤均为粉红色;HXBSM组和YXSFC组在造模后第4～5天局部皮肤变黑，第8～9天出现新生毛发，第17天皮肤变灰;而模型组约在第 6天 皮肤变黑，第11天出现新生毛发，第17天皮肤变灰。其中皮肤变黑的时间头端早于尾端。
2.2 对小鼠皮肤局部血管新生的影响 因实验过程中有动物死亡，各组第4和11天均处死10只，第17天HXBSM组和YXSFC组均处死9只，模型组处死8只。同组小鼠不同时间拔毛局部真皮浅层毛细血管数相比，HXBSM组在造模后第11天和第17天时明显多于第4天（ P <0.05），模型组第 17天 时明显多于第4天和第11天（ P <0.05）;同一时间不同组别相比，第4天和第11天时HXBSM组新生血管数较模型组增加（ P <0.05），YXSFC组第11天时新生血管数较模型组增加（ P < 0.05 ）;而第11天时，HXBSM组明显多于YXSFC组（ P <0.05）;第17天时，3组小鼠局部毛细血管数目相比，差异无统计学意义（ P >0.05）。见表1。
2.3 对小鼠皮肤局部毛囊中VEGF表达的影响 同组小鼠不同时间拔毛局部毛囊中VEGF的表达相比，HXBSM组和YXSFC组在造模后第11天高于第4天（ P <0.05），第17天高于第11天和第 4天 （ P <0.05）;模型组在第11天和第17天高于第4天（ P <0.05），而第11天和第17天相比，差异无统计学意义（P>0.05）。同一时间不同组别相 比，第4天时各组小鼠毛囊中VEGF的表达量差异无统计学意义（ P >0.05）;第11天和第17天时，HXBSM组VEGF的表达量高于YXSFC组和模型组（ P <0.05）;第17天YXSFC组VEGF的表达量高于模型组（ P <0.05）。见表1、图1。
表1 各组小鼠局部血管新生和皮肤局部毛囊中VEGF表达（略）
Table 1 Skin blood vessel neogenesis and expression of VEGF in hair follicle of mice in three groups
*P <0.05， vs day 4;△P <0.05， vs day 11;▲P <0.05， vs untreated group;□P <0 1 2 下一页
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