【摘要】 全反式维甲酸（all-trans retinoic acid， ATRA）治疗急性早幼粒细胞白血病，引起白血病细胞与内皮细胞之间黏附增加，是发生维甲酸综合征的重要原因。本文观察雷公藤红素对这种黏附增加的影响。方法:用流式细胞术检测雷公藤红素对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vascular endothelial cell， HUVEC）在ATRA刺激下表达黏附分子的影响。用细胞黏附功能实验，检测雷公藤红素对ATRA导致的上述两种细胞之间黏附增加的影响。结果:ATRA能引起NB4细胞表面细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1， ICAM-1）表达增加，但可被雷公藤红素明显抑制（ P <0.01）。NB4细胞上清液能刺激HUVEC表达ICAM-1（ P <0.05）;而被ATRA处理过的NB4细胞上清液能明显刺激HUVEC表达选择素E（E-selectin）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1， VCAM-1）和ICAM-1等黏附分子（ P <0.01），雷公藤红素对其抑制率分别达25.3%、42.4%和61.0%。ATRA导致上述两种细胞之间黏附增加，雷公藤红素对其完全抑制。结论:雷公藤红素能抑制ATRA导致的白血病细胞与内皮细胞黏附，有可能用于维甲酸综合征的治疗。
【关键词】 雷公藤红素
维甲酸综合征是全反式维甲酸（all-trans retinoic acid， ATRA）治疗急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia， APL）过程中出现的一种具炎症性特征和能导致死亡的严重并发症。其发生机制虽不完全清楚，但一般认为，与ATRA导致白血病细胞与内皮细胞的黏附能力增加，进而使大量细胞浸润组织和器官有关［1～3］。最近，我们发现，雷公藤红素能抑制炎症因子活化的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vascular endothelial cell， HUVEC）表达黏附分子，并抑制内皮细胞与白细胞的黏附［4］，提示其有可能用于维甲酸综合征的治疗。本研究以急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4和HUVEC为细胞模型，观察雷公藤红素对ATRA导致NB4细胞与HUVEC黏附增加的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂 ATRA，Sigma公司产品，用无水乙醇溶解，贮存浓度为100 mmol/L， -20 ℃ 冰箱中保存。工作浓度为1 μmol/L，用培养液临时配制。雷公藤红素，上海中山医院药剂科提取及纯化，方法见文献［5］，DMSO溶解，贮存浓度为100 mmol/L， -20 ℃冰箱中保存，工作浓度为200 nmol/L，用培养液临时配制。荧光直标鼠抗人VCAM-1-PE和E-selectin-PE，美国BD公司产品;鼠抗人ICAM-1-FITC，法国Diaclone公司产品。
1.2 NB4细胞培养 NB4细胞由法国国家医学与健康研究院602研究单位提供（源自美国ATCC）。RPMI 1640（Invitrogen， 法国），10%小牛血清（Cambrex， 法国），1%青霉素-链霉素，37 ℃，5% CO2培养。取对数生长期的细胞进行实验。
1.3 HUVEC培养 HUVEC细胞由法国国家医学与健康研究院602研究单位提供。分离及培养方法见文献［4］。EBM2培养液（Invitrogen， 法国），加5%小牛血清，1%青霉素-链霉素，0.4%重组人纤维母细胞生长因子-B（recombinant human fibroblast growth factor-B， rhFGF-B）、0.1%重组人血管内皮生长因子（recombinant human vascular endothelial growth factor， rhVEGF）、0.1%长效胰岛素样生长因子（long R insulin-like growth factor， R3-IGF-1） 和0.1 %重组人上皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor， rhEGF），均为法国Cam-brex公司产品，37 ℃，5% CO2培养。取3～5代的HUVEC进行实验。
1.4 NB4细胞上清液的制备 取对数生长期的NB4细胞，按终浓度为2×105/ml加入培养体系进行传代培养。设对照、雷公藤红素、ATRA、ATRA+雷公藤红素4组，均设复孔。37 ℃，5% CO2培养24 h。300 g 离心5 min，弃细胞，再1 200 g 离心 10 min ，收集上清，-20 ℃冻存。
1.5 ATRA和雷公藤红素对NB4细胞黏附分子表达的影响 取对数生长期的NB4细胞，按终浓度为2×105/ml进行培养。设对照、雷公藤红素、 ATRA 、ATRA+雷公藤红素4组，均设复孔。 37 ℃ ，5% CO 2培养24 h［2］。选择素E（E-selectin）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion mole-cule-1， VCAM-1）和细胞间黏附分子-1（intercellu-lar adhesion molecule-1， ICAM-1）的表达情况用流式细胞术检测［4］。
1.6 NB4细胞上清液对HUVEC表达黏附分子的影响 取贴壁生长良好的HUVEC，按5×10 4/ml，接种于24孔培养板中，每孔1 ml。待细胞长满时，分别加入NB4细胞上清液（与培养液等体积），设对照组，均设复孔。E-selectin、VCAM-1和ICAM-1的检测同1.5。
1.7 抗体标记 取1×10 5个细胞，PBS清洗两遍后，分别与荧光直标鼠抗人E-selectin-PE、VCAM-1-PE和ICAM-1-FITC，于4 ℃反应30 min，总体积20 μl。然后转移至含PBS的流式细胞仪测定管，总体积250 μl。
1.8 流式细胞术检测 FACS Calibur（美国BD公司）的发射激光由氩离子激光器产生，功率为 15 mW ，激发光波长为488 nm。FITC和PE荧光分别设在FL-1和FL-2荧光通道上，测定前用校准荧光微球校正仪器，每测定管收集10 000个细胞，采用Cell Quest软件进行结果分析。
1.9 细胞黏附功能实验 NB4细胞和HUVEC分别接受ATRA、雷公藤红素和NB4细胞上清液处理24 h后，按试剂盒（法国Molecular Probes公司）操作说明书进行。取5×105未处理或处理的NB4细胞，用PBS洗两遍后，悬浮于1 ml不含血清的 RPMI 1640培养液中。加5 μl荧光染料calcein AM于悬浮细胞，使calcein AM最后浓度为 5 μmol/L ，充分混匀后，置37 ℃孵 1 2 3 4 下一页
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