【关键词】 缺血再灌注损伤; 血栓素A2; 前列环素; Na+K+ATP酶; Ca2+Mg2+ATP酶
肝脏缺血再灌注损伤是肝切除、严重肝外伤以及肝脏移植手术中经常遇到的问题和导致术后肝功能衰竭的重要原因。研究表明缺血再灌注导致肝脏损伤的机制与细胞能量代谢障碍、线粒体功能受损、细胞内钙超载、氧自由基产生、一些细胞因子的合成与释放等有关。参附注射液由人参、附子提取物组成，其有效成分为人参皂苷和乌头类生物碱。本文通过观察参附注射液对血栓素A2（thromboxane A2, TXA2）和前列环素（prostacyclin, PGI2）、Na+K+ATP酶和Ca2+Mg2+ATP酶的影响探讨参附注射液保护肝缺血再灌注损伤的机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组与给药 24只Wistar大鼠，体质量200～250 g，随机分为肝缺血再灌注模型组和参附注射液（Shenfu Injection, SF）治疗组。SF治疗组给予参附注射液（雅安三九药业有限公司，批号031115）10 ml/kg腹腔注射，1次/d，连续给药6 d，第6天于手术前30 min给药。模型组大鼠同样方法给予相同剂量的生理盐水。两组均于第6天手术，给药期间常规自由喂养，给水。
1.2 动物模型及取材 术前12 h禁食，自由饮水。10％水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，剃除腹部体毛，局部消毒，取腹正中切口开腹，开腹后离断肝周韧带，包括镰状韧带、肝胃韧带、冠状韧带，消除肝脏侧枝循环。用Pringle’s法（无创伤微血管夹夹闭门静脉、肝动脉、胆总管）使肝缺血，持续15 min后松开血管夹，恢复肝脏血供，然后关腹。分别于再灌注1 h和3 h再次开腹。先取一次性5 ml无菌注射器吸取消炎痛EDTANa2 0.2 ml，自下腔静脉肝下段快速抽取静脉血3 ml，即刻在空针内颠倒混匀，3 500 r/min（上海手术器械厂802型离心沉淀器）、4 ℃离心15 min，分离血浆，－20 ℃保存。用取肝组织镊子快速夹取大小约1 cm3和0.5 cm3两块肝组织，PBS液冲洗后分别置于10％福尔马林溶液中固定和2.5％戊二醛溶液中固定，用于光学显微镜和电镜检查。快速切取剩余肝组织，PBS液冲洗后立即置于液氮中冷冻，用锡箔纸包裹置于液氮中保存，再转至－80 ℃冰箱中保存，待测Na+K+ATP酶和Ca2+Mg2+ATP酶。然后处死大鼠。
1.3 检测指标与方法
1.3.1 血浆TXA2和PGI2的稳定代谢产物血浆血栓素B2（thromboxane B2, TXB2）和6酮前列腺素F1α（6ketoprostaglandin F1α, 6ketoPGF1α）测定 用放免法进行测定，6ketoPGF1α和TXB2试剂盒购自北京解放军总医院科技开发中心放免所，按照说明书进行操作。
1.3.2 肝组织ATP酶水平的测定 ATP酶测试盒购自南京建成生物工程研究所，底物三磷酸腺苷钠购自中国科学院上海生物化学研究所。用电子天平称取冰冻肝脏组织100 mg，先用比色法按考马斯亮蓝试剂盒说明书操作，测定肝组织匀浆的蛋白含量，蛋白含量（g/L）=（测定管吸光度/标准管吸光度）×标准管浓度（g/L）；同样用比色法按测试盒说明测定组织匀浆中ATP酶的活性，ATP酶活力（μmol Pi·mg prot1·h1）=［（测定管吸光度－对照管吸光度）/标准管吸光度］×标准管浓度（1 μmol/ml）×反应体系中样本稀释倍数×6÷组织中蛋白含量（mg prot/ml）。
1.3.3 组织细胞学改变 分别采用光学显微镜和T. JEM1200EX透射电子显微镜观察。
1.4 统计学方法 肝组织ATP酶水平和血浆TXB2、6ketoPGF1α测定结果以x±s表示，应用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，采用成组t检验。
2 结果
2.1 血浆TXB2、6ketoPGF1α浓度 肝脏缺血15 min，再灌注3 h后SF治疗组血浆TXB2浓度较模型组低，而6ketoPGF1a浓度升高，TXB2/6ketoPGF1α比值明显降低（P<0.05）。见表1。
2.2 肝组织中ATP酶水平 肝缺血15 min，再灌注1 h和3 h，SF治疗组肝组织中Na+K+ATP酶和Ca2+Mg2+ATP酶水平均明显高于模型组（P<0.05）。见表2。
2.3 组织细胞学改变 光镜下模型组肝细胞浊肿、大片坏死，肝窦和微血管内明显淤血。SF治疗组肝窦内淤血和组织损伤明显减轻，可见小灶状坏死。电镜下模型组肝细胞膜缺损、不连续，甚至溶解；细胞器中线粒体损伤尤为明显，大量线粒体空泡变性、外膜溶解；核异染色质边集、凝集成块，核膜不规则；SF治疗组肝细胞损伤较轻，胞膜较完整，线粒体和内质网较丰富，核内充盈，但亦有染色质边集。见图1～4。
表1 再灌注3 h血浆TXB2、6ketoPGF1α浓度及其比值（略）
Table 1 Plasma concentrations of TXB2 and 6ketoPGF1α and their ratio after threehour reperfusion
*P＜0.05, vs untreated group.
表2 再灌注1 h和3 h肝组织中ATP酶水平（略）
Table 2 Levels of hepatic tissue ATPases after one or threehour reperfusion
*P＜0.05, vs untreated group.
图1 模型组肝细胞浊肿、窦内淤血、大片坏死（HE染色，×100）（略）
Figure 1 Massive hepatocyte swelling, necrosis, sinusoidal and microvascular congestion in untreated group (HE staining, ×100)
图2 SF治疗组肝窦内淤血和组织损伤明显减轻，可见小片状坏死（HE染色, ×100）（略）
Figure 2 Sinusoidal congestion and tissue injury were reduced significantly in SFtreated group (HE staining, ×100)
图3 模型组肝细 1 2 3 下一页
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