【关键词】 基因
Effect of antisense oligodeoxynucleotide bcl2 on expression of Bcl2 protein and cell cycle of lens epithelial cells induced by galactose
【Abstract】 AIM: To investigate the effect of antisense oligodeoxynucleotide bcl2 (bcl2 ASODN) on the expression of Bcl2 protein and the cell cycle of rabbit lens epithelial cells（LECs）induced by galactose. METHODS: From translation initiation region of bcl2 gene, oligonucleotides were synthesized and modified with phosphorothioate. Rabbit lens were treated with galactose and bcl2 ASODN. The influence of bcl2 ASODN on the level of Bcl2 protein expression and the cell cycle of LECs induced by galactose was detected by flow cytometry. RESULTS: 5.0-15.0μmol/L of bcl2 ASODN reduced the level of Bcl2 protein expression on LECs induced by galactose, with the fluorescence intensity decreasing from 158.70±2.14 to 113.94±2.88, and decreased the number of S phase cells of Lens from 20.60% to. 0.67%. CONCLUSION: bcl2 ASODN can inhibit the level of Bcl2 protein expression on LECs induced by galactose, interfere the entry of LECs into the S phase and inhibit the proliferation of LECs.
【Keywords】 genes, bcl2; oligonucleotides, antisense; galactose; lens, crystalline/cytology
【摘要】 目的： 探讨反义bcl2 寡核苷酸(bcl2 ASODN)对半乳糖诱导的兔晶状体中Bcl2蛋白表达及细胞周期的影响. 方法： 人工合成与bcl2基因翻译起始区序列互补的寡核苷酸并磷酸化修饰，用半乳糖和bcl2 ASODN处理体外培养的兔晶状体，流式细胞术检测bcl2 ASODN对半乳糖诱导的LEC中Bcl2蛋白表达水平及细胞周期的影响. 结果： 5.0 ~15.0 μmol/L反义bcl2 寡核苷酸能下调半乳糖诱导的晶状体上皮细胞中Bcl2蛋白的表达，荧光强度从158.70±2.14降至113.94±2.88，同时可降低S期细胞数，从20.60%降至0.67%. 结论： bcl2 ASODN能抑制半乳糖诱导的晶状体中Bcl2蛋白的表达水平，阻止细胞进入S期，抑制细胞增殖.
【关键词】 基因，bcl2 ；寡核苷酸类，反义；半乳糖；晶体/细胞学
0引言
近年的研究表明，一些癌基因的异常表达与晶状体上皮细胞（lens epithelial cells, LEC）的增殖和分化密切相关，bcl2基因是一种与细胞增殖、分化和凋亡密切相关的原癌基因，研究认为LEC的增殖与bcl2基因的表达有关［1］，而bcl2的过度表达能诱导转基因鼠白内障的形成. 为了探讨白内障的发病机制及反义bcl2寡核苷酸片段对半乳糖性白内障治疗的可行性，我们通过导入bcl2 ASODN，观察其对半乳糖诱导的晶状体中Bcl2蛋白表达及细胞周期的影响，现报道如下.
1材料和方法
1.1材料
反义寡核苷酸的制备：根据bcl2基因翻译起始区序列设计ASODN，碱基序列如下［2］： 5′AGCGTCCGCCATCCTTCC3′ （由上海Sangong公司合成，两端各硫代修饰3个碱基）. 使用前加消毒双蒸水溶解，配成浓度为61.6 μmol/L的原液，于95℃水浴变性5 min，冰上骤冷备用. 临用前用DMEM培养液稀释成相应浓度使用.
1.2方法
1.2.1晶状体组织培养取4~6 wk白色无眼疾家兔，雌雄不拘，体质量0.4~0.75 kg，耳缘静脉空气栓塞处死，立即按常规无菌操作摘除眼球，1∶1000庆大霉素生理盐水冲洗干净，在超净台内剪去角膜和虹膜，用眼科无齿镊小心取出完整晶状体放入含DMEM完全培养基的24孔培养板中，每孔放置1枚晶状体，37℃, 50 mL/L CO2条件下培养，2 d后取出观察，除去在剥取过程中受损的晶状体，选择完好透明的晶状体待用.
1.2.2实验分组培养晶状体组织加入无血清培养基使细胞同步化，继续培养24 h后换用含50 mL/L FBS的DMEM培养基，实验分为3大组，第1组为正常对照组，只加培养基（含50 mL/L FBS）；第2组为半乳糖组，加含30 mmol/L半乳糖的培养基；第3组为bcl2 ASODN组，培养基（含30 mmol/L半乳糖）中bcl2 ASODN终浓度分别为5.0, 10.0, 15.0 μmol/L. 每组设6个平行组，取平均值.
1.2.3流式细胞仪检测Bcl2蛋白的变化上述各组晶状体组织培养24 h后取出，分离晶状体前囊膜，剪碎，细胞分离机分离后800 r/min离心8 min，弃上清（去掉组织碎片），加PBS 2 mL振荡混匀制成单细胞悬液，10 g/L多聚甲醛室温固定， 1500 r/min离心8 min，弃固定液，细胞重悬于5 mL/L Triton X100 1 mL中，37℃水浴30 min，以增加细胞膜通透性并封闭非特异性抗原，离心，沉淀分别按组加入100 μL一抗（bcl2 多克隆抗体），另设一组以100 μL PBS代替一抗作为上 1 2 3 下一页
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