【关键词】 急性病
Experimental study on PMN in acute severe pancreatitis with lung injury
【Abstract】 AIM: To study the apoptosis and necrosis of polymorphonuclear neutrophils (PMN) from bronchoalveolar lavage fluid in acute severe pancreatitis (ASP) and to discuss the related mechanism. METHODS: Fortyeight male SD rats were divided into 2 groups (ASP group and control group). ASP model was established by injecting with 35 g/L taurocholic acid into the biliopancreatic duct. Both groups were sacrificed at 3, 6 and 12 h with 8 rats at each time point. At scheduled time, bronchoalveolar lavage fluid was drawn and PMNs were then obtained by gradient density gradient centrifugation method. The ratio of apoptosis and necrosis of PMN was assayed by flow cytometry and LDH as well as index of lung permeability were measured. RESULTS: In ASP group, the survival ratio of PMN increased and apoptosis of PMN was delayed. The level of LDH in bronchoalveolar lavage fluid and the index of lung permeability also increased. CONCLUSION: The delay of PMN apoptosis leads to persistent activation and leakage of toxic contents of PMN, which are closely associated with lung injury
【Keywords】 acute disease; pancreatitis; lung/injuries; neutrophils
【摘要】 目的： 探讨急性重症胰腺炎(ASP)合并急性肺损伤时肺泡灌洗液中性粒细胞(PMN)凋亡和坏死的发生规律及可能涉及的作用机制. 方法： 选取雄性SD大鼠48只，分为ASP实验组（24只）、对照组（24只）. 实验组大鼠穿刺胰胆管并注入35 g/L牛磺胆酸钠制作ASP大鼠模型，分别在制模后3, 6, 12 h剖杀，于预定时相取支气管灌洗液，密度梯度离心分离ＰＭＮ，用流式细胞仪测定PMN凋亡、坏死比例，同时测定乳酸脱氢酶(ＬＤＨ)含量、肺通透指数. 结果： ASP组大鼠肺灌洗液中ＰＭＮ存活细胞比例增加（P<0.01），凋亡延迟. 同时，肺灌洗液ＬＤＨ明显升高（P<0.01），肺通透指数显著增加（P<0.01）. 结论： ASP合并急性肺损伤时,PMN凋亡延迟，造成ＰＭＮ持续处于激活状态及毒性内容物的持续释放，与急性肺损伤密切相关.
【关键词】急性病；胰腺炎；肺/损伤；中性白细胞
0引言
急性重症胰腺炎(ASP)时大量中性粒细胞(PMN)聚集、扣押于肺组织中，并在其后发生的急性肺损伤(ALI)中起重要作用. PMN是急性呼吸窘迫综合征（ARDS）发生、发展的关键细胞［1］，其在肺内如何消散在一定程度上决定着ARDS的转归. 目前，对于ASP并发ALI 时扣押于肺组织中的PMN的作用及其转归，以及与肺损伤发生发展的关系等问题研究尚少. 我们通过制备大鼠ASP合并ALI模型，动态观察肺灌洗液中PMN凋亡的发生规律，以揭示PMN在ALI中的作用.
1材料和方法
1.1材料
雄性SD大鼠48只（西安交通大学动物实验中心），体质量260～300 g, Percoll分离液为Pharmacia公司产品，AnnexinvFITC 凋亡检测试剂盒(AnnexinvFITC Apoptosis Detection Kit)系Sigma 公司产品. 采用Hitachi7170全自动生化分析仪，美国BD公司流式细胞仪FACS.calibur，Hitachi600型透射电镜.
1.2方法
将大鼠于实验前12 h禁食，自由饮水，采用100 g/L氯氨酮80 mg/kg ip麻醉，随机分为实验组及对照组，每组各24只. 常规消毒，腹正中切口进入腹腔. 实验组分别于十二指肠及肝门端用小动脉夹暂时夹闭阻断胰胆管. 近肝门端用4号头皮针穿刺胰胆管，1 min内匀速注入35 g/L牛磺胆酸钠1 mL/kg,压迫注射点，5 min后去除动脉夹，逐层关闭腹腔，完成ASP模型制作. 对照组仅翻动十二指肠. 实验及对照组大鼠均每8只为一时间点，分别于术后3, 6, 12 h剖杀. 解剖分离肺，由主气管插入塑料管，注入10 mL PBS液，反复灌洗3次，回收液体，回收率约80％左右. 灌洗液经离心后，分别留取上清及细胞沉淀. 将细胞沉淀用PBS液重新悬浮，用密度梯度离心Percoll 液（密度分别为1.085和1.095）行密度梯度离心（700 g 4℃ 30 min），吸取PMN富集层并进一步洗脱纯化，将所获PMN稀释至 1 mL备用. 肺泡灌洗液及血液乳酸脱氢酶（LDH）检测应用全自动生化分析仪检测. 用光镜及电镜观察肺组织的病理变化. 取肺泡灌洗上清液，测定白蛋白及总蛋白含量，计算白蛋白/总蛋白比值.
1.2.1PMN凋亡/坏死细胞定量取上述PMN悬浮液，加500 μL细胞悬液于试管中,加入5 μL用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Annexin V和10 μL的碘化丙啶(PI)，室温下避光放置10 min，采用膜联蛋白VFLUOS和碘化丙啶双标法，用流式细胞仪双通道检测5000个细胞，激发波长488 nm，发射波长515, 610 nm. 膜联蛋白Ｖ阳性为凋亡早期细胞，PI阳性为坏死细胞，膜联蛋白V，P 1 2 3 下一页
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