【摘要】 目的 检测非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）、癌旁组织及肺良性病变组织中垂体瘤转化基因（pituitary tumor transforming gene,PTTG）及血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor，VEGFC)的表达和微淋巴管密度(lymphatic microvessel density，LMVD)值，并探讨三者间的相互关系。方法 应用实时荧光定量 PCR 和免疫组织化学方法检测非小细胞肺癌组织中 PTTG、VEGFC mRNA 和蛋白及 LMVD 的表达，分析 PTTG、VEGFC 及 LMVD 与 NSCLC 临床病理特征的关系，以及 PTTG、VEGFC 和 LMVD 三者之间的相互关系。同时，对随访资料进行生存分析，绘制生存率曲线，探讨 PTTG、VEGFC 对肺癌患者预后的影响。结果 PTTG、VEGFC mRNA 和 LMVD 值在不同性质的肺病变组织中的表达均有显著性差异(P均＜005)，在不同年龄、性别、是否吸烟、肿瘤大小、组织学类型及分化程度间无显著性差异(P均＞005)，在TNM分期、淋巴结转移与否及预后组间有显著性差异(P均＜005)。PTTG、VEGFC 蛋白表达在淋巴结转移与否及预后组间有显著性差异(P均＜005)。生存率曲线显示 PTTG、VEGFC 高表达者生存时间均短于低/无表达者(P=0030，0027，n=65)。PTTG 在肺癌组织中的表达与 VEGFC、LMVD 密切相关，随着 PTTG 强度增加，VEGFC 分级及 LMVD 值亦增加。结论 PTTG、VEGFC 的过度表达促使肿瘤微淋巴管的生成，进而促进了肿瘤细胞淋巴结转移。PTTG 和 VEGFC 表达可作为判断 NSCLC 生物学行为及肺癌患者预后的良好指标，VEGFC 有望成为肺癌抗淋巴管治疗的新靶点。
【关键词】 垂体瘤转化基因；血管内皮生长因子C；微淋巴管密度；实时荧光定量PCR
垂体瘤转化基因(PTTG)是1997年〔1〕 被发现并证实与细胞增殖、分化和凋亡有关的癌基因。血管内皮生长因子(VEGF)C 被认为是迄今发现的唯一特异性新生淋巴管刺激因子,可促进肿瘤微淋巴管生成及肿瘤细胞向区域淋巴结转移。有研究〔2〕 显示 PTTG 可通过促进 VEGFC 的过度表达，促使肿瘤细胞发生淋巴结转移。国内外已报道 PTTG 在食管癌、胃癌和卵巢癌等多种肿瘤中高表达，但目前尚未见对 PTTG 在肺癌中表达研究的报道。以往关于 VEGFC 的研究多为蛋白半定量分析，本实验结合免疫组化应用实时荧光定量 PCR 对非小细胞肺癌(NSCLC)组织中 PTTG、VEGFC 的表达进行精确定量分析，并检测微淋巴管密度(LMVD)的表达情况,旨在探讨它们与 NSCLC 临床病理特征及预后的关系。
1 材料与方法
11 研究对象
收集65例 NSCLC 组织，均来自手术切除且经病理科常规病理学检查证实。男∶女为40∶25，年龄43～78（中位数588）岁。依据1997年新的修订标准进行TNM分期，其中Ⅰ期7例，Ⅱ期28例，Ⅲ期26例，Ⅳ期4例；按病理形态学分为鳞状细胞癌36例，腺癌26例，大细胞癌3例；按分化程度分为高分化5例，中分化18例，低分化42例；按有无淋巴结转移分为有淋巴结转移37例，无淋巴结转移28例。所有患者均为原发性 NSCLC，术前均未接受过化疗或放疗等任何治疗。同时取65例配对的癌旁组织和20例肺良性瘤样病变组织(包括结核球10例，错构瘤4例，炎性假瘤4例，肺纤维组织细胞瘤1例，肺隐球菌感染1例)。癌旁组织为距肿块边缘5 cm以上的正常组织。肺癌组织和肺良性病变组织均取自肿块中央非坏死部分。标本经10％甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋。65例患者无住院期间死亡，随访日期以患者手术日期起计算，术后随访至2006年5月。
12 实验用品
RNAiso Reagent、SYBR ExScriptTM RTPCR Kit(DRR053S) 均购自TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其他各种化学试剂均为进口或国产分析纯。采用ABI PRISM 7000 实时 PCR扩增仪。兔抗人多克隆抗体 PTTG、VEGFC、VEGFR3及免疫组织化学试剂盒PV9000均购自北京中山生物技术公司。
13 实验方法
131 实时荧光定量
1311 总RNA的提取
每100 mg组织匀浆后，加入TRIzol Reagent 1 ml，然后加入02 ml氯仿，离心后吸取上清，加入05 ml异丙醇，离心沉淀后弃上清，75% 乙醇洗沉淀，DNase Ⅰ酶解可能残余的基因组DNA。RNA 溶于DEPC 水，甲醛变性凝胶电泳，分光光度计检测浓度和纯度。
1312 cDNA的合成
反转录仪为 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司)。采用10 μl反转录反应体系，4μl 溶解于去RNA酶的双蒸水，05μl 随机引物（100 μmol），2 μl 5×ExSciptTM Buffer，025μl ExSciptTMRTase（200 U/μl），025 μl RNA酶抑制剂（40 U/μl），05μl dNTP 混合物(各10 mmol)，加去RNA酶的蒸馏水至10μl。反应条件：42 ℃15 min（反转录反应）；95℃2 min（反转录酶的失活反应）。
1313 荧光定量PCR扩增
引物：由TaKaRa公司提供的高特异性引物, PPTG 上游引物序列5′CCTCAGATGAATGCGGCTGTTA3′，下游引物序列5′AGCTTCAGCCCATCCTTAGCAA3′，扩增片段为118 bp。VEGFC 上游引物序列5′CAGCACGAGCTACCTCAGCAAG3′，下游引物序列5′TTTAGACATGCATCGGCAGGAA3′，扩增片段为115 bp。荧光定量 PCR 仪为ABI PRIS 1 2 3 4 下一页
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